Identificación de las especies del género Leihmania mediante marcadores moleculares de alta sensibilidad a partir de láminas coloreadas con Giemsa empleando la técnica PCR-High Resolution Melting (HRM)

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad causada por el protozoario del género Leishmania, que se transmite a los humanos por la picadura de flebótomos infectados. El Perú reportó un promedio de 7000 casos de leishmaniasis cutánea y 430 de leishmaniasis cutáneo-mucosa en el 2016. Las principales especies infectantes del género Leishmania son Leishmania (Viannia) braziliensis, causante del 98% de los casos de leishmaniasis mucosa y cutáneo-mucosa; Leishmania (V.) peruviana, causante de la leishmaniasis cutánea y en menor proporción Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (Leishmania) amazonensis y Leishmania (V.) shawi. La diversidad de especies del género Leishmania y su amplia distribución en el territorio peruano requieren la búsqueda de métodos que permitan identificar las especies de forma sencilla, reproducible y eficiente. En la investigación se realizó el análisis por PCR-High Resolution Melting (HRM) para cuatro marcadores moleculares, la región conservada del minicírculo, ITS-1, hsp70 y cyt b en 243 láminas coloreadas con Giemsa de los años 2010-2013 procedentes de pacientes con lesiones cutáneas. El análisis de genotipificación identificó las especies de Leishmania (V.) peruviana, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (L.) amazonensis, cuya sensibilidad de técnica fue 93.00%. Además, el análisis de las curvas de disociación o HRMA permitió la identificación de especie de Leishmania desde la concentración equivalente a 1 parásito/reacción. La identificación de especies, el límite de detección y la eficiencia en la identificación especies de Leishmania spp a partir de láminas coloreadas con Giemsa mediante la técnica de PCR- HRM requiere el uso de marcadores multicopia, como la región conservada del minicírculo. La aplicación de la técnica PCR-HRM en muestras de láminas es una herramienta molecular novedosa, sencilla y útil por el fácil almacenamiento y transporte de las muestras de pacientes desde las regiones más lejanas del país, lo cual podría permitir el pronóstico del desarrollo de la enfermedad y estudios epidemiológicos.

Leishmaniasis is a disease caused by the protozoan of the genus Leishmania, and is transmitted to humans by sandfly bites. Peru reported an average of 7,000 cases of cutaneous leishmaniasis and 430 cases of cutaneous-mucosal leishmaniasis in 2016. The most important causal agents of Leishmaniasis are Leishmania (Viannia) braziliensis, which causes 98% of cases of mucosal and cutaneous-mucosal leishmaniasis, Leishmania (V.) peruviana, which causes cutaneous leishmaniasis and Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (V.) shawi in less rate. The diversity of species of the genus Leishmania and its wide distribution in the Peruvian territory require the search of methods that allow to identify the species in a simple, reproducible and efficient way. The investigation was carried out by PCR – High Resolution Melting (HRM) analysis for four molecular markers, the conserved region of the minicircle, ITS-1, hsp 70 and cyt b in 243 Giemsa stained smears of the years 2010-2013 with lesions cutaneous. The genotyping assay allowed the correct assignment of five Leishmania species (Leishmania (V.) peruviana, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (L.) amazonensis), whose sensitivity of technique was 93.00% . In addition, the analysis of the dissociation curves or HRMA allowed the identification of Leishmania species from the concentration equivalent to 1 parasite / reaction. The identification of species, the limit of detection and the efficiency in identifying species of Leishmania spp from sheets colored with Giemsa by the PCR-HRM technique requires the use of multicopy markers, such as the conserved region of the minicircle. The application of the PCR-HRM technique in sheet samples is a novel molecular tool, simple and useful for the easy storage and transportation of patient samples from the most distant regions of the country, which could allow the prognosis of the development of the disease and epidemiological studies.