Influencia de los medios y proporción hormonal en el fluido folicular sobre la competencia de ovocitos de alpaca in vitro

Abstract

La aplicación de biotecnologías reproductivas requiere cantidades significantes de ovocitos maduros viables; sin embargo, existen pocos estudios utilizando indicadores de calidad ovocitaria. Por lo tanto, el objetivo de investigación fue determinar la influencia de los medios de maduración y proporción hormonal en el fluido folicular sobre la competencia de ovocitos de alpaca in vitro. Los ovarios de alpaca (n = 58) se obtuvieron del matadero, se transportaron al laboratorio en termos con solución salina a 33-36 °C y se sometieron a aspiración folicular. El líquido folicular aspirado según diámetro folicular fue centrifugado y almacenado a -20 ºC hasta determinar las concentraciones hormonales mediante ELISA. Por otro lado, se obtuvieron un total de 532 ovocitos. Los ovocitos fueron seleccionados, aleatorizados y distribuidos en uno de los dos grupos experimentales (Medio de maduración 1 (MM1) y Medio de maduración 2 (MM2)) con tres repeticiones por experimento. La maduración in vitro se llevó a cabo en una incubadora portátil durante 40 h en condiciones de 5% de CO2 (producido por gránulos efervescentes) y 38,5 °C (por baño termostático). La maduración nuclear se evaluó mediante tinción con acetato de orceína, la maduración citoplasmática mediante tinción con azul de cresilo brillante (BCB), la apoptosis mediante la tinción anexina V/IP y la morfometría mediante Image J Software. La maduración nuclear se clasificó según la etapa meiótica. La maduración citoplasmática se clasificó por la presencia (BCB+) o ausencia (BCB-) del BCB. La apoptosis se midió según la intensidad de fluorescencia (%). La morfometría se evaluó midiendo el diámetro, espesor de la zona pelúcida y el área del espacio perivitelino del ovocito. Los resultados de las concentraciones hormonales fueron 3115,34 ± 940,35 pg/ml para estrógeno (E2), 827,45 ± 419,44 pg/ml para progesterona (P4), 5,88 ± 5,57 ng/ml para testosterona (T2) y 1,10 ± 0,48 ng/ml para la hormona antimülleriana (AMH), encontrando correlaciones positivas entre las concentraciones de E2 y P4 (r = 0,099; P = 0,772), E2 y T2 (r = 0,574; P = 0,065), E2 y AMH (r = 0,180; P = 0,618), P4 y T2, (r = 0,091; P = 0,790) T2 y AMH (r = 0,192; P = 0,413), pero correlación negativa entre P4 y AMH (r = -0,265; P = 0,459). Los niveles de E2 en el líquido folicular están en el rango informado por otros investigadores. En folículos mayores de 15 mm se encontraron niveles bajos de E2 y T2. Las concentraciones de P4 en el líquido folicular a los diferentes diámetros foliculares no fueron diferentes (P>0.05); lo mismo, se observó para los niveles de AMH en el líquido folicular que no fueron diferentes entre folículos de diferente diámetro (P>0.05). Además, se encontraron proporciones altas de E2/P4 y bajas de E2/T2 en folículos que oscilaban entre 4 y 10 mm. La tasa de maduración nuclear en metafase II, no muestran diferencias significativas (P=0.088) entre MM1 (46.08 ± 5.90 %) y MM2 (54.65 ± 3.00%). La tasa de maduración citoplasmática de MM1 (67,78 ± 4,50 %) fue significativamente menor comparado con MM2 (77,61 ± 3,58) % (P = 0,014). Los resultados de la anexina V mostraron diferencias significativas (P = 0,0057) entre MM1 (51,95 ± 33,23) % y MM2 (12,95 ± 2,34) %; mientras, los resultados de ioduro de propidio en MM1 (16,57 ± 6,98) % y MM2 (15,81 ± 3,06) % no presentaron diferencias significativas (P = 0,8124). Para el diámetro del ovocito, MM1 (133,42 ± 14,56 μm) y MM2 (136,14 ± 15,2 μm) no fueron significativos (P=0,397), lo mismo para el grosor de la zona pelúcida, MM1 (16,84 ± 3,96 μm) y MM2 ( 16,73 ± 4,98 μm) no fueron diferentes (P = 0,919); sin embargo, el área del espacio perivitelino, MM1 (11018.91 ± 2465.40 μm2) y MM2 (8686.18 ± 3016.88 μm2) presentaron diferencias significativas (P=0.0005). Se concluye que los ovocitos entre 4 y 10 mm podrían ser adecuados para el cultivo in vitro; además, el medio de cultivo MM2 presenta mejores resultados para la obtención de ovocitos viables.The application of reproductive biotechnologies requires significant amounts of viable mature oocytes; however, there are few studies using indicators of oocyte quality. Therefore, the research objective was to determine the influence of the maturation media and hormonal ratio in the follicular fluid on the competence of alpaca oocytes in vitro. Alpaca ovaries (n = 58) were obtained from the slaughterhouse, transported to the laboratory in thermos with saline solution at 33-36 °C and subjected to follicular aspiration. The follicular fluidaspirated according to follicular diameter was centrifuged and stored at -20 ºC until hormone concentrations were determined by ELISA. On the other hand, a total of 532 oocytes were obtained. The oocytes were selected, randomized and distributed in one of the two experimental groups (Maturation Medium 1 (MM1) and Maturation Medium 2 (MM2)) with three repetitions per experiment. In vitro maturation was carried out in a portable incubator for 40 h under conditions of 5% CO2 (produced by effervescent granules) and 38.5 °C (by thermostatic bath). Nuclear maturation was assessed by orcein acetate staining, cytoplasmic maturation by brilliant cresyl blue (BCB) staining, apoptosis by annexin V/PI staining, and morphometry by Image J Software. Nuclear maturation was classified according to the meiotic stage. Cytoplasmic maturation was classified by the presence (BCB+) or absence (BCB-) of the BCB. Apoptosis was measured according to fluorescence intensity (%). Morphometry was evaluated by measuring the diameter, thickness of the zona pellucida and the area of the perivitelline space of the oocyte. The results of the hormone concentrations were 3115.34 ± 940.35 pg/ml for estrogen (E2), 827.45 ± 419.44 pg/ml for progesterone (P4), 5.88 ± 5.57 ng/ml for testosterone (T2) and 1.10 ± 0.48 ng/ml for antimüllerian hormone (AMH), finding positive correlations between the concentrations of E2 and P4 (r = 0.099; P = 0.772), E2 and T2 (r = 0.574 ; P = 0.065), E2 and AMH (r = 0.180; P = 0.618), P4 and T2, (r = 0.091; P = 0.790) T2 and AMH (r = 0.192; P = 0.413), but negative correlation between P4 and AMH (r = -0.265, P = 0.459). E2 levels in the follicular fluid are in the range reported by other investigators. In follicles larger than 15 mm, low levels of E2 and T2 were found. The concentrations of P4 in the follicular fluid at the different follicular diameters were not different (P>0.05); the same was observed for AMH levels in follicular fluid that were not different between follicles of different diameter (P>0.05). In addition, high E2/P4 and low E2/T2 ratios were found in follicles ranging from 4 to 10 mm. The rate of nuclear maturation in metaphase II does not show significant differences (P=0.088) between MM1 (46.08 ± 5.90%) and MM2 (54.65 ± 3.00%). The cytoplasmic maturation rate of MM1 (67.78 ± 4.50%) was significantly lower compared to MM2 (77.61 ± 3.58) % (P = 0.014). Annexin V results showed significant differences (P = 0.0057) between MM1 (51.95 ± 33.23) % and MM2 (12.95 ± 2.34) %; meanwhile, the results of propidium iodide in MM1 (16.57 ± 6.98) % and MM2 (15.81 ± 3.06) % did not present significant differences (P = 0.8124). For the diameter of the oocyte, MM1 (133.42 ± 14.56 μm) and MM2 (136.14 ± 15.2 μm) were not significant (P=0.397), the same for the thickness of the zona pellucida, MM1 ( 16.84 ± 3.96 μm) and MM2 (16.73 ± 4.98 μm) were not different (P = 0.919); however, the perivitelline space area, MM1 (11018.91 ± 2465.40 μm2) and MM2 (8686.18 ± 3016.88 μm2) presented significant differences (P=0.0005). It is concluded that oocytes between 4 and 10 mm could be suitable for in vitro culture; In addition, the MM2 culture medium presents better results for obtaining viable oocytes.