Diseño de tamizados genéticos en Saccharomyces cerevisiae usando una biblioteca genómica de plásmidos multicopia

Abstract

Los tamizados genéticos de sobreexpresión de proteínas son considerados métodos que utilizan análisis modernos para explorar sistemáticamente funciones de genes in vivo. En la presente investigación, se optimizaron los protocolos de dos tamizados que usaron una biblioteca genómica como fuente de diversidad génica. Esta biblioteca proviene de miles de diferentes fragmentos de ADN genómico de la levadura S. cerevisiae. En el primer método, se realizaron réplicas de colonia transformantes que fueron luego expuestas a radiación UV o sembradas en medio con peróxido de hidrógeno. En el segundo método, se utilizaron incubaciones de células transformantes los cuales se distribuyeron en placas para ser expuestas a radiación UV y paralelamente, otros cultivos de transformantes fueron tratados con peróxido de hidrógeno. Posterior a los tamizados, se realizaron ensayos con radiación UV y peróxido de hidrógeno para confirmar los fenotipos positivos mostrados. En el análisis de secuencias de los cinco plásmidos obtenidos de los tamizados, se encontraron genes involucrados en la reparación celular ante presencia de oxidantes. En conclusión, los métodos de tamizados diseñados mostraron ser eficientes para la selección de plásmidos que incluyen genes que contribuyen a mitigar o reparar los daños sometidos a las células de levadura.Genetic screenings that rely on protein overexpression are methods that use modern analysis to systematically explore gene functions in vivo. The present investigation involved the optimization of two screening protocols that used a genomic library as a source of genetic diversity. This library is formed by thousands of diferent fragments of genomic DNA from the yeast S. cerevisiae. In the first method, transformed colonies were transferred by replica plating, and the replicated plates were exposed to UV radiation or seeded in medium containing hydrogen peroxide. After the screenings, tests were carried out with UV radiation and hydrogen peroxide to confirm the positive phenotypes. A total of five plasmids were isolated in the screenings and their analysis identified genes involved in the cellular response to damaging agents. In conclusion, the optimized screening protocols allowed identification of genomic library plasmids that included genes involved in the response to cellular damage..