Construcción de dos bibliotecas de plásmidos para la síntesis y secreción de oligopéptidos aleatorios o semialeatorios en S. cerevisiae

Abstract

A pesar de estar constituidos por unos pocos aminoácidos (2 a 20), los oligopéptidos presentan gran diversidad en su composición y tienen varias importantes aplicaciones. Importantemente, es posible producir una gran variedad de éstos para permitir la investigación de sus propiedades recurriendo a diferentes estrategias, entre las cuales destaca la construcción de bibliotecas de plásmidos. A su vez, los oligopéptidos sintetizados pueden tener diferentes destinos, por ejemplo, el interior celular, algún organelo en particular, o ser secretadas o ancladas en la superficie celular. De esta manera, una vez construidas las bibliotecas usando plásmidos de expresión, se procede a realizar una búsqueda de aquellos oligopéptidos con las características deseadas a través de estrategias de tamizado. En esta tesis se reporta la estrategia seguida para lograr la producción y secreción de una gran variedad de oligopéptidos aleatorios y semialeatorios en la levadura Saccharomyces cerevisiae, mediante la construcción de las respectivas bibliotecas de plásmidos. Los fragmentos a clonar fueron obtenidos mediante una estrategia de PCR que fue optimizada para garantizar el máximo rendimiento y reproducibilidad. El ensamblaje de los plásmidos de expresión para formar la biblioteca se realizó mediante clonación in vivo, consiguiendo altas eficiencias de clonación (62.5 % a 70 %).

Although all oligopeptides are formed by a few amino acids (2 to 20), they are diverse and have many important applications. Importantly, it is possible to produce them to allow investigation of their properties using a variety of techniques, including the construction of plasmid libraries. In turn, the synthesized oligopeptides might have different destinations, for example, inside the cell, to be secreted into the extracellular space or anchored on the cell surface. Thus, once these libraries have been obtained, a search for the desired oligopeptides is carried out through screening strategies. This thesis describes the production and secretion of a great variety of oligopeptides, using the yeast Saccharomyces cerevisiae. The random and semi-random fragments to be cloned were obtained via an optimized PCR strategy that allowed their efficient and reproducible generation. An in vivo cloning strategy was applied for the assembly of the expression plasmids and library construction, achieving high cloning efficiencies (62.5 to 70 %).