Estudio de la actividad antifúngica de bacterias promotoras del crecimiento vegetal y sus metabolitos contra fitopatógenos del cultivo de Frijol

Abstract

Phaseolus vulgaris es originario del continente americano. En el Perú es una de las legumbres más consumidas por su alto contenido de nutrientes. El objetivo de esta investigación fue realizar el estudio de la actividad antifúngica de bacterias promotoras del crecimiento vegetal y sus metabolitos en el control de hongos fitopatógenos en el cultivo del frijol. Para lo cual se realizó la bioprospección de bacterias nativas de la rizosfera de plantas de frijol común crecidas en diferentes ecosistemas de la zona costera del Perú. A partir de las cepas aisladas se realizó la selección de bacterias antagonistas contra hongos fitopatógenos del suelo Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani mediante la técnica de cultivo dual. La capacidad antifúngica de las cepas seleccionadas se evalúo a través de la producción de compuestos orgánicos volátiles y no volátiles. Los metabolitos volátiles fueron identificados por microextracción en fase sólida – cromatografía de gases - espectrometría de masas; mientras que la evaluación de la actividad antifúngica por compuestos no volátiles incluyo la producción de compuestos extracelulares antibióticos, sideróforos y de las enzimas hidrolíticas lipasas, celulasas, proteasas y quitinasas. Para la purificación de los compuestos extracelulares antibióticos con actividad antifúngica se realizó la precipitación del sobrenadante libre de células añadiendo HCl 2N hasta un pH 2, posteriormente se realizó la extracción líquido - líquido utilizando solventes orgánicos polares y apolares. El extracto crudo fue purificado por cromatografía líquida al vacío, cromatografía Flash y HPLC en fase reversa. La caracterización de los compuestos antifúngicos se realizó por LC-MC. Así también, se realizó la caracterización de estabilidad frente a diferentes valores de temperaturas y pH, se evalúo su capacidad biosurfactante y se determinó la concentración mínima inhibitoria. A partir de la cepa con mayor actividad antifúngica se realizó la optimización del medio de cultivo para incrementar la producción de compuestos extracelulares antibióticos a nivel de matraz seleccionando la mejor fuente de carbono, nitrógeno y elementos traza y a nivel de biorreactor de tanque agitado modificado de 3 L de capacidad se evalúo el efecto de la agitación y aireación en el incremento de la producción de compuestos extracelulares antibióticos. Se realizó el modelamiento matemático para la producción de compuestos antifúngicos extracelulares. En campo se evalúo la eficacia de rizobacteria en la reducción de la incidencia de la enfermedad causada por Sclerotinia, en los parámetros de crecimiento vegetal y en el rendimiento de grano. Veintiséis cepas aisladas mostraron la capacidad de controlar el crecimiento micelial de Sclerotinia, Fusarium y Rhizoctonia debido a la producción de compuestos orgánicos volátiles y no volátiles. La secuencia del gen ARNr 16S mostró que las cepas estaban estrechamente relacionadas con Bacillus, Paenibacillus, Achromobacter, Pseudomonas, Serratia y Alcaligenes. Las cepas Alcaligenes TvPs2.4 y Pseudomonas TvPs1.6 mostraron la mayor inhibición contra los fitopatógenos probados a través de la producción de compuestos orgánicos volátiles estas cepas produjeron 21 compuestos orgánicos volátiles.Phaseolus vulgaris is original from the American continent. In Peru it is one of the most consumed legumes due to its high content of nutrients. The aim of this study was to evaluated the antifungal activity of plant growth-promoting bacteria and their metabolites in the control of phytopathogenic fungi in bean crops. The bioprospecting of native bacteria from the rhizosphere of common bean plants grown in different ecosystems of the coastal zone of Peru was carried out. From the isolated strains, the selection of antagonistic strains against phytopathogenic soil fungi Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani was carried out using the dual culture technique. The antifungal capacity of the selected strains was evaluated through the production of volatile and non-volatile organic compounds. Volatile metabolites were identified by solid phase microextraction – gas chromatography - mass spectrometry. The evaluation of the antifungal activity by non- volatile compounds included the production of extracellular antibiotic compounds, siderophores and the hydrolytic enzymes lipases, cellulases, proteases and chitinases. For the purification of the extracellular antibiotic compounds with antifungal activity, the cell-free supernatant was precipitated by adding HCl 2N until a final pH 2. Subsequently, the liquid-liquid extraction was carried out using polar and nonpolar organic solvents. The crude extract was purified by vacuum liquid chromatography, Flash chromatography and reverse phase HPLC. The characterization of the antifungal compounds was carried out by LC-MC.