Genómica y edición génica como herramientas moleculares para el mejoramiento de la cepa Aspergillus fumigatus LMB-35Aa

Abstract

La edición génica mediante el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 en hongos filamentosos ha abierto un campo de estudio amplio debido a la simplicidad de su uso en la manipulación genética. El presente trabajo tuvo como objetivo implementar esta tecnología como prueba de concepto para el mejoramiento genético de la cepa A. fumigatus LMB-35Aa con el fin de incrementar su capacidad de producción de enzimas celulolíticas. Para cumplir este objetivo, se utilizaron técnicas microbiológicas, bioquímicas, genéticas y moleculares que permitieron encontrar las condiciones adecuadas de producción de celulasas en un sistema de fermentación por biopelículas, la identificación de los genes involucrados en la degradación de celulosa, la purificación y caracterización de una endoglucanasa, así como la elección de un sistema adecuado de edición génica. En este sentido, el presente documento detalla el crecimiento en biopelícula de la cepa LMB-35Aa a 28 °C por 72 h, utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como fuente de carbono e inductor de la producción de celulasas. Bajo estas condiciones, se obtuvo títulos enzimáticos de 0.059 U/mg para celulasas totales (FPAsa), 0.197 U/mg para endoglucanasas y 0.108 U/mg para β-glucosidasas. Además, se identificaron 16 genes de celulasas putativos en el transcriptoma de la cepa LMB-35Aa; de los cuales, se lograron clonar en la bacteria E. coli las endoglucanasas Egl2, Egl3, Egl7 y Afu7g06150. De estas proteínas, la Afu7g06150 se logró expresar, purificar y finalmente determinar las condiciones óptimas de actividad a 50 °C y pH 3, con una actividad de 0.75 U/mg. Finalmente, se consiguió la edición del genoma de la cepa LMB 35Aa utilizando CRISPR/Cas9 para inserción (knock-in) de la endoglucanasa EglA de A. niger ATCC 10864 en la localización del gen pksP del genoma de la cepa LMB-35Aa. La cepa editada genéticamente presentó un incremento de un ~40 % en su actividad endoglucanasa respecto a la cepa silvestre. Los resultados presentados demuestran el éxito en la implementación de la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 en la cepa nativa A. fumigatus LMB-35Aa para la producción de una enzima celulolítica (EglA) en un sistema de biopelícula, así como el gran potencial de esta técnica para su utilización en diferentes estudios genéticos y biotecnológicos en cepas nativas.

Gene editing by using CRISPR/Cas9 technology in filamentous fungi has opened a wide field of study due to the feasibility of its use in genetic manipulation. The main goal of this research was to implement this technology for the genetic improvement of the A. fumigatus LMB-35Aa strain to produce cellulolytic enzymes in a biofilm system. To reach this objective, microbiological, biochemical, genetic, and molecular techniques were carried out that allowed finding the appropriate conditions for cellulase production in a biofilm system, as well as the identification of genes involved in cellulose degradation, purification and characterization of an endoglucanase, and the recognition of a suitable gene editing system. In this regard, this document details the biofilm growth of the LMB-35Aa strain at 28 °C for 72 h, using Carboxymethylcellulose (CMC) as a carbon source and cellulase inducer. Under these conditions, enzymatic titers of 0.059 U/mg for total cellulases (FPAse), 0.197 U/mg for endoglucanases and 0.108 U/mg for β-glucosidases were obtained. In addition, 16 putative cellulases were identified in the transcriptome of LMB-35Aa strain; from these endoglucanases; Egl2, Egl3, Egl7 and Afu7g06150 were cloned into E. coli. Afu7g06150 was express, purify, and finally determine the optimal conditions of activity at 50 °C and pH 3 with an activity of 0.75 U/mg. Finally, genome edition of LMB-35Aa strain was achieved by using CRISPR/cas9 for knock-in eglA gene from A. niger ATCC 10864 at the location of the pksP gene in LMB-35Aa genome. The edited strain showed an increase of ~40% in its endoglucanase activity compared to the wild strain. The results show the successful implementation of CRISPR/Cas9 gene editing technology in the native strain A. fumigatus LMB-35Aa to produce a cellulolytic enzyme (EglA) in a biofilm system as well as the great potential of this technique for genome edition in different genetic and biotechnological research in native strains.